一步法sgRNA 合成试剂盒
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| CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，也是细菌和古细菌为应对噬菌体和外源质粒的攻击而演化来的一种获得性免疫防御机制。此系统的工作原理是通过人工优化的具有引导作用的sgRNA (Single Guide RNA)引导核酸酶Cas9蛋白在与sgRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，引起DNA断裂，进而利用生物体内非同源末端修复机制或同源重组机制修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失。 sgRNA的体外合成通常有两种策略：一种为构建含特异性序列的转录质粒，另一种则使用合成的oligo退火延伸生成含T7转录启动子的双链DNA分子，进而再使用T7 RNA聚合酶进行体外转录，从而获得sgRNA。利用合成的Oligo直接制备sgRNA，具有操作简单快速、可实现高通量等优势，已经成为体外合成sgRNA的首选方案。Cas9的切割是通过向导RNA(gRNA)与靶DNA形成约20bp碱基的配对，且靶序列的3’端需要有PAM结构(NGG)，再引导Cas9作用实现的。本试剂盒可通过一步反应获得高纯度、高产量的sgRNA，仅需要合成一条含有特定靶标序列的Oligo，可最短在4h内获得30~50μg的sgRNA。 |
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组份 |
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原理 |
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储存 |
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| -20℃可保存2年，避免反复冻融。 | ||||||||||||||||||
实例 |
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| Fig. 应用一步法sgRNA合成试剂盒获得的sgRNA，分别为37℃孵育30min、1h、2h、8h和过夜孵育的sgRNA，孵育时间越长，sgRNA产量越高。 | ||||||||||||||||||